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α-葡萄糖苷酶

α-葡萄糖苷酶为水解酶的一种。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内,它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键,也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键,在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。

1、α-葡萄糖苷酶的简介
α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20,α-Glucosidases) 为淀粉水解酶类中的一种,主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键,产生α-D-葡萄糖,通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷,能以蔗糖和多聚糖为底物。同时,
它还具有转糖苷作用,可将低聚糖中的,α-1,4-糖苷键转化成α-1,6-糖苷键或其他形式的链接,从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。Ⅰ型α-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对--硝基苯酚α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ,且水解速率比低聚麦芽糖快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性,而对芳基葡萄糖苷活性低。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似,但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。
2、α-葡萄糖苷酶来源及分布
α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛,种类繁多,性质各异,几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外,绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶,其中产酶较多的是黑曲霉,市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所
得。
3、微生物α-葡萄糖苷酶研究现状
微生物来源的α-葡萄糖苷酶相对分子量一般在50~120kDa之间。不同来
源的α-葡萄糖苷酶的相性质则差异很大。同一种属的微生物,除少数外,它们所产生的α-葡萄糖苷酶性质差异也较大。例如,枯草杆菌属的不同α-葡萄糖苷酶分子量一般在65~120kDa,有些属酸性水解酶,有些属中性水解酶,最适温度各异,底物专一性也不尽相同,有的主要降解直链淀粉、有的水解麦芽糖和低聚麦芽糖、有的具有较宽的底物专一性,可水解多种底物。 不同的嗜热菌产生的α-葡萄糖苷酶,分子量差异较大,嗜热温度低的为65℃,最高可达到 100℃。

3.1枯草杆菌α-葡萄糖苷酶 
1991年Bradley等研究了嗜热枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus) α-葡萄糖苷酶。2种酶均具有胞内低聚-1,4-α-葡萄糖苷酶活性,经薄层分析,它们水解直链低聚麦芽糖产生麦芽糖和葡萄糖,并水解普鲁兰。二者均不水解Pnpg、麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖或潘糖。2种酶均由二亚基组成,分子量分别为55kDa和60kDa,最适pH分别为7.5和7.0,对底物p-硝基-α-D-麦芽糖苷的K m分别为2.96mM和1.31mM。他们在1993年进一步研究了嗜热芽孢枯草杆菌转化株(H-17) α-葡萄糖苷酶。此酶为胞内酶,具有水解低聚-1,4-糖苷键活性,也可水解直链麦芽低聚糖产生麦芽糖和葡萄糖,同时还具有普鲁兰酶活性,水解普鲁兰产生麦芽糖、葡萄糖及( 异构) 潘糖。此酶对pNPG、麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、( 异构)潘糖无活性,但对淀粉有轻微的水解作用。原酶为二亚基,亚基分子量为5.5kDa,等电点pI4.8,最适pH7.5,5Mm Tris溶液可80%抑制其活性,对p-硝基苯酚-α-D麦芽糖苷K m值为1.46Mm,最适酶活力温度65℃,其嗜热活性需要最低浓度0.02%的巯基乙醇或 0.005Mm的EDTA。氨基酸分析发现H-17株产生的酶与枯草杆菌2S产生的酶相比,前者具有较多数量的疏水氨基酸残基,是酶热稳定性和水解活性增加的原因。 
3.2 出芽短梗霉菌胞内α-葡萄糖苷酶 
出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulasns)可产胞内α-葡萄糖苷酶,1993年Badal等将此酶经Trition X-100溶解、Q-Sephacry处理,羟磷灰石、辛基---琼脂糖柱层析、Sephacryl S -200 (丙烯葡聚糖凝胶) 过滤可纯化124倍,酶活达到316.82 U蛋白。在50℃时最适Ph4.0,稳定pH范围3.0~6.0,在60℃时稳定,最适活力温度为60℃。部分纯化的酶分解麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖和海藻糖,水解相对速率分别为100,60,47,和50,对多聚糖无活性或活性很低,酶活性不需要金属离子参与。

3.3芽孢杆菌α-葡萄糖苷酶  
Takii等研究的嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothmophilus)ATCC12016α-葡萄糖苷酶可从非还原末端专一性水解麦芽糖和α-葡聚糖的α-1,4-糖苷键。它的核苷酸序列推断为1665个碱基对,由555个残基组成,分子量为6.52kDa。此酶与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC7064、嗜热葡萄糖苷酶地衣芽孢杆菌( Bacillus thermoglucosidasius)KPI006、卡尔斯伯酵母(Saccharomyes carlsbergensis)CBII、枯草杆菌(Bacillus sp.)SAM1606枯草杆菌等的葡萄糖苷酶和变性链球菌(Streptococcus mutans) 的右旋葡萄糖苷酶及大肠杆菌 ( Escherichia coli)ECLII6 的海藻糖6-磷酸水解酶具有40%~57% 的序列相似性( 所有这些酶均显示出于蜡状芽孢杆菌( B.cereus) 葡萄糖苷酶相似的X衍射二级结构。他们认为此酶位于N-端的一个活性中心,为(α/B)桶状折叠结构。 
2009 年Arzu 等对地衣芽孢杆菌(Geobacillus sp. )A343和嗜热菌A343的嗜热α-葡萄糖苷酶性质进行了研究。他们从地衣芽孢杆菌A343和嗜热菌A343中部分纯化分离出2种嗜热的α-葡萄糖苷酶。A343的α-葡萄糖苷酶最适温度60℃、Ph6.8、对pNPG底物的Km值为1.38Mm.A343α-葡萄糖苷酶最适温度65℃、Ph8.5。 通过20种底物专一性和薄层层析分析证明A343α-葡萄糖苷酶具有较高的转糖苷活性,而A343α-葡萄糖苷酶有较宽的底物专一性。A343α-葡萄糖苷酶底物为麦芽糖、糊精、松二糖、麦芽三糖、麦芽戊糖、麦芽四糖、麦芽六糖、苯基葡萄糖吡喃。A343α-葡萄糖苷酶更多的水解糊精、松二糖、麦芽糖、苯基葡萄糖吡喃苷、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽六糖、异麦芽糖、蔗糖和曲二糖等的α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6键。60℃保温5h,A343 和A333 的活性保留分别为 92 %和83% 。经试验测试它们能抵抗许多变性剂#抑制剂和金属离子2种α-葡萄糖苷酶的转糖苷活性和淀粉水解能力均具有潜在的开发价值。 
3.4 曲霉α-葡萄糖苷酶 
黑曲霉(Aspergillus niger)在以木薯淀粉为碳源的培养基中可产生2种葡萄糖淀粉水解酶: α-葡萄糖酶和α-淀粉酶。2种酶经硫酸铵沉淀、离子交换层析和2次凝胶过滤层析可纯化为2种纯酶,葡萄糖淀粉酶 1和葡萄糖淀粉酶2,分子量分别为74kDa和96kDa,等电点 pI分别为3.8和3.95,最适 pH则分别为4.2和4.5,稳定pH范围 3.5~9.0。这2种酶均有嗜热性,最适温度分别为60℃和65℃,在60℃时酶活性可稳定1h。酶动力学分析表明2种酶水解支链淀粉均比直链淀粉更有效,说明2种酶均具有α-葡萄糖苷酶的水解活性。 
3.5 其他微生物的α-葡萄糖苷酶 
疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)在生长过程中可用右旋糖作为碳源,它们在早期的发育过程中能产生一种具有降解右旋糖的α-葡萄糖苷酶。酶活高峰期在培养22 h后出现,在菌种培养的稳定期,由于其他蛋白酶的影响,酶的活力极快地降低。此酶是一种高活性的水解葡聚糖苷的α-葡萄糖苷酶。 
4 α-葡萄糖苷酶研究发展趋势 
1982年日本林原生化研究所成功筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种,使该酶得以实现工业化规模发酵生产,产品大量应用于淀粉加工业和食品工业。此后,各种新型的α-葡萄糖苷酶及其新的应用受到空前的重视。 
从α-葡萄糖苷酶研究的历史进程分析,对它的研究可分为3个方面: ① 主要集中在生α-葡萄糖苷酶的微生物菌种的筛选方面,涉及菌种培养、酶活力提高、酶分离纯化和酶的基本理化性质研究;②集中在酶的氨基酸序列分析、酶的结构分析、酶的催化机理研究等; ③集中在酶的应用开发,包括酶的水解底物专一性、酶水解底物的条件和速度、酶催化反应产物及应用开发、新型α-葡萄糖苷酶开发及应用等。 
目前,α-葡萄糖苷酶已广泛应用于淀粉水解、酒精发酵、低聚异麦芽糖生产、化学合成、代谢机理研究、临床检测和疾病治疗等领域。国外对α-葡萄糖苷酶的研究较深入,经文献检索已报道的各类α-葡萄糖苷酶研究达几十种,日本、美国、丹麦等国家已实现微生物发酵α-葡萄糖苷酶的工业化生产。我国对α-葡萄糖苷酶研究还处于起步阶段,主要集中在第一方面的研究,对酶的结构、催化机制、酶应用和酶产品开发等方面的报道很少,更没有工业化α-葡萄糖苷酶的产品,研究和生产用酶基本上全部依赖进口。今后我国α-葡萄糖苷酶的研究和产品开发任重而道远。 

 

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