抗坏血酸过氧化物酶活性测定

在茶叶中 实验原理 APX（抗坏血酸过氧化物酶）催化AsA与H2O2 反应而使H2O2:2AsA+ H2O2→2MD-AsA( 单脱氢抗 坏血酸)+2H2O。

抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血 酸为电子供体的，APX首先与H2O2形成中间复合 物，中间复合物接着氧化AsA形成产物，当AsA未 被复合物利用时，APX失活。只要AsA能够再生， APX就能充分进行催化反应，从而保护叶绿体维持 正常的光合能力。 APX酶液的制备 称取0.5g的茶树鲜叶剪碎，加入适量 的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴 中充分研磨，离心（10000g、4℃、20min） 取上层清夜1mL，分装于小离心管中置于 4℃备用或-20℃保存。

APX活性的测定

提取液：50mmol/LPBS（磷酸氢二钾-磷酸二 氢钾缓冲液），pH7.8；2mmol/L AsA； 5mmol/L EDTA。 反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。 在三个比色皿中各加入20? L鲜叶APX粗酶液， 再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和 H2O2启动反应；每10s连续记录室温下290nm 吸光值的变化X。室温下每一分钟氧化 1? molAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）。

计算公式

每克鲜叶APX的酶活性U= （X×7.5×1000×60×1000）/ （m×2.8×20×10） 上式中，X：OD值的变化；7.5：每克材料 提取7.5mL粗酶液；1000：将ml转化成?L； 60：将1min转化成60s；1000：将mmol转化 成?mol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8： 吸光系数mmol/L cm；20：用20?L酶液进行 活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。 测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件 PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍，提取液 pH为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。

注意事项：

（1）由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降 低来计算APX活性，因此所加的酶量一般不宜过大 ，应使加液量控制在60s内，使产生的A290光值下 降呈良好的线性关系。

（2）由于此反应中AsA和H2O2量都很少，可以将 30%的H2O2稀释500倍，在测定时直接吸取15?L的 H2O2与3mL反应液将加入到比色皿中，启动反应。

（3）H2O2由于本身对AsA的氧化作用在测定时间 内可以忽略不计。

酶制剂相关产品如下：

因 酶制剂产品众多，如：过氧化氢酶 粉末、α-葡萄糖苷酶，详情进入酶制剂产品页