超氧化物歧化酶的活性测定

超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定 黄嘌呤氧化酶法

原 理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 超氧阴离子自由基（O2-），后者氧化羟胺形成亚 硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光 分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时， 则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使 形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值 低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被 测样品中的SOD活力。 实验试剂： 硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。

实 验步骤： 计算方法： 每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应 的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测 样品中的SOD 活力由下式计算： SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1） /A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数× 样本测试前的稀释倍数 式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的 吸光值。

邻苯三酚 自氧化法  原理： 在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧 化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间 产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反 应时间呈良好的线性关系。 SOD 加入邻苯 三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴 离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生 成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧 化速率降低，可作为测定 SOD 活性的理论 依据。

1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH8.2 2mmol/L EDTA) 0.2mol/L （Tris）三羟甲基氨基甲烷(内含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 与 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加双蒸水至 200ml pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰 箱备用。

2.仪器: 紫外分光光度计，酸度计，恒温 水浴锅

实 验步骤： （1）.邻苯三酚自氧化速率测定： 在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris缓冲溶液，于 25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L邻苯三 酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。 ? . SOD活性测定： 将样液加入到Tris缓冲溶液中，其余步骤同自 氧化速率测定方法。 活力单位定义：将一定条 件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量 定义为一个单位（u）。

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