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谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase)的活性检测方法

1. 目的

本程序是为了建立谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase)的活性检测方法,适用于GLDH成品的活性检测。

2. 范围

  适用于GLDH成品、半成品及其他样品的检测。

4. 定义

   U: 在pH7.3, 37度的环境下, 每分钟转化1umolα-酮戊二酸变成L-谷氨酸所需要的酶量。

   活性: 每毫升样品中的活性值。

   比活: 每毫克蛋白的活性值。

5. 内容

5.1原理

α-Ketoglutarate + NH3 + NADH + H+        L-Glutamate+ NAD+ +H2O

NADH的消耗可以通过340nm的光吸收进行检测。

5.2试剂:

A  0.1 M Tris-HCl 缓冲液, pH 8.3

B  1.5M NH4Cl溶液

C  0.225M α-酮戊二酸溶液(pH 7.0-9.0)

D  7.5mM NADH溶液

E   酶稀释液: 0.1 M Tris-HCl 缓冲液, pH 8.3

试剂的配制方法详见各试剂配制记录,配制人员需完整填写配制记录。

5.3 操作规程:

5.3.1仪器参数设定

若仪器中无已保存参数,按以下参数设定。若已有相关参数,调取后确认。

检测方法:动力学扫描

测量波长:340nm         测量时间:180s

延迟时间:60s            积分时间:120s

系数/因子:6.776          测量温度:30±1℃

5.3.2 样品准备

若待测样品为固体,可以按10mg 样品/1000ul 超纯水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。

5.3.3 检测方法

5.3.3.1 在石英比色皿中加入2.5ml 试剂A, 200ul试剂B,100ul 试剂C, 100ul D于30度孵育2min。

5.3.3.2 加入50ul 样品后, 温和混匀后开始测定。

5.3.3.3 测定结束后,记录相应数值:起始读数、△A/min test、活性值(U/ml)。

5.3.3.4 活性值(U/ml)范围为0.1-0.3U/ml,若超出范围,待测样品需经试剂D稀释后再次进行检测。

5.3.3.5测定样品前需检测空白反应值,即其他操作不变,用500ul E代替样品加入比色皿后进行反应,测定△A/min blank。

5.3.3.6计算公式  活性(U/ml) =(△A/min test-△A/min blank)×6.776×df (稀释倍数)

5.4 成品检测结果精密度要求:每个样品检测时,在线性范围内选择三个不同的稀释度进行测定,得到的原液/粉末活性,计算Cv值,Cv值得要求为<5%,达到要求后,此次测定的结果认为有效, 取三个检测数值的平均数作为最终的检测数值。若不能达到,对此三个稀释应进行重新检测。

此方法仅作为参考!

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